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【综述】正常垂体细胞和垂体神经内分泌肿瘤细胞的转录组学谱

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垂体是大脑中细胞最多样化的区域之一。转录组生物学的最新进展,如单细胞RNA测序,带来了一个前所未有的窥见垂体的分子组成,无论是在其正常生理状态和疾病。破译正常的垂体转录组学特征可以更好地了解五种内分泌细胞的本体论起源和发展,这一过程涉及复杂的转录因子级联,目前仍在建立中。

与这些关于正常垂体发育的观察平行,最近关于垂体神经内分泌肿瘤(PitNETs)的转录组学研究结果表明,与腺体发育期间相比,转录因子表达模式既保留又改变。此外,最近的研究还确定了驱动各种肿瘤行为的差异表达基因,包括激素高分泌和肿瘤进袭(aggression)。了解PitNETs的综合多组学特征对于开发目前基于分子特征的治疗模式无法治愈的PitNETs疗法至关重要,并最终有助于使PitNETs与将精确医学应用于其他肿瘤的突破保持一致。

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1.引言

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垂体由不同种类的细胞组成,调节基本的稳态功能,包括代谢、生殖和生长。垂体前叶的细胞簇的主要特征是它们产生并分泌到血液循环中的内分泌激素。促肾上腺皮质激素细胞产生促肾上腺皮质激素(ACTH),促性腺激素细胞产生卵泡刺激素(FSH)和促黄体生成素(LH),生长激素细胞产生生长激素(GH),泌乳素细胞产生泌乳素(PRL)。所有垂体内分泌细胞都受到上游下丘脑神经元的严格调控,并在响应内外部稳态信号时呈现不同的基因表达状态。

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垂体神经内分泌肿瘤(PitNETs)(原称为垂体腺瘤)是一种常见的起源于垂体前叶神经内分泌细胞的颅内肿瘤。PitNETs可引起颅内肿块占位效应,包括头痛、头晕、视力障碍或垂体激素缺乏。近一半的PitNETs产生过量的激素。患者高分泌PitNETs的体征和症状因其神经内分泌类型而异。例如,高分泌性泌乳素细胞瘤(泌乳素瘤)会引起泌乳,并抑制下丘脑-垂体-性腺轴,导致更年期、不孕症或勃起功能障碍。高分泌性生长激素细胞瘤导致肢端肥大症和巨人症。此外,高分泌促肾上腺皮质激素细胞瘤可导致库欣病,其特征为体重增加、向心性肥胖、皮肤紫纹和面部多血症(weight gain, central obesity, skin striae, and facial plethora)。

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与高分泌性PitNETs不同,无功能PitNETs可能是偶然发现的,或表现为肿块占位效应的迹象,而不是激素分泌过量的症状。一些无功能PitNETs是“静默性PitNETs”,它们的垂体前叶激素和转录因子免疫组化(IHC)呈阳性,尽管它们临床显著水平上无激素的分泌。虽然大多数静默性PitNETs是静默性促性腺激素细胞的,但所有类型的高分泌PitNETs都可以有一个静默性对应的(即静默性泌乳素细胞瘤、静默性生长激素细胞瘤或静默性促肾上腺皮质激素细胞瘤)。

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PitNETs的遗传和分子发病机制是多种多样的。不足5%的PitNETs源于种系突变,作为综合征性疾病的一部分(即,多发性内分泌肿瘤-1 (MEN1)中的MEN1基因突变)或作为家族性孤立性垂体腺瘤)。其余95%的PitNETs是在调节细胞周期、细胞信号转导和转录改变的各种基因的散发体细胞突变的背景下发生的,由于所有PitNETs缺乏普遍的变化,因此很难确定这些肿瘤的致病遗传变化。

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2.发育中和发育后正常的脑下垂体

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2.1发育过程中和发育后正常的促肾上腺皮质激素细胞(TPIT -谱系)转录因子

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在正常的促肾上腺皮质激素细胞发育过程中,T-box转录因子TPIT(也称为TBX19)在组织特异性同源结构域转录因子PITX1的帮助下激活标志基因POMC(图1)。转基因小鼠中TPIT的过表达区分了垂体促肾上腺皮质激素细胞谱系,而TPIT的双敲除导致促肾上腺皮质激素细胞的缺失。在缺乏TPIT的情况下,正常分化为促肾上腺皮质激素细胞的垂体神经内分泌细胞转而分化为促性腺激素细胞或促甲状腺激素细胞[13]。这表明TPIT抑制改变的细胞谱系命运(This suggests that TPIT suppresses altered cell lineage fates.)。

图1在发育过程中特定的转录因子驱动正常的垂体细胞分化。垂体干细胞分化为五种专门的产生内分泌激素的细胞类型:促肾上腺皮质激素细胞(ACTH)、生长激素细胞(GH)、泌乳素细胞(催乳素)、促甲状腺激素细胞(TSH)和促性腺激素细胞(LH和FSH)。垂体细胞分化需要复杂的转录因子级联,其中许多转录因子仍在被鉴定的过程中。图中只突出显示了选定的转录因子。

在人胎儿垂体(human fetal pituitary)中,scRNA-seq显示在促肾上腺皮质激素细胞谱系的中间状态,有基本的螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子基因NEUROD1的峰值表达[scRNA-seq shows a peaked expression of NEUROD1, a basic helix-loop-helix (bHLH) tranion factor gene, at the intermediate states of the corticotroph lineage]。尽管NEUROD1可能可能不是促肾上腺皮质激素细胞谱系的必要条件,但它是促肾上腺皮质激素细胞分化的适当时机所必需的(NEUROD1 may be required for the appropriate timing of corticotroph differentiation , although it may not be necessary for corticotroph lineage commitment)。在小鼠中,NEUROD1的敲除导致短暂的促肾上腺皮质激素细胞分化延迟,但TPIT的表达没有变化。因此,独特的基因可能调节正常垂体细胞分化的特定方面,如适当的时间。

2.2. PIT1谱系正常垂体细胞的发育

PIT1(也称为POU1F1)是POU结构域的转录因子,对于正常垂体细胞的末端细胞分化和基因表达至关重要,垂体细胞继续分泌神经内分泌激素PRL, GH和TSH。这些PIT1谱系的正常垂体细胞的形成受到PROP1的正调控和HESX1的负调控。

2.3. 发育过程中和发育后正常生长激素细胞的转录途径

在正常的生长激素细胞中,PIT1靶基因NEUROD4(也称为MATH3)参与细胞成熟和增殖。NEUROD4双敲除小鼠GH和生长激素释放激素受体(GHRHR)特异性下调。然而,在NEUROD4敲除小鼠中,生长激素细胞成熟的阻断(blockage)可能是短暂的。虽然GH阳性细胞数量减少,但在NEUROD4敲除小鼠的产后仍可检测到,尽管GHRHR的表达仍然很低。这些发现表明,与促肾上腺皮质激素细胞中的NEUROD1类似,NEUROD4可能调节生长激素细胞分化的适当时间,而不是调节细胞的最终命运。

在其他基因中,scRNA-seq测序显示FOXO1和CEBPD在人胎儿生长激素细胞中表达上调。小鼠垂体特异性FOXO1双敲除导致生长激素细胞终末分化延迟和GHRHR表达降低。此外,FOXO1敲除导致NEUROD4表达降低。因此,FOXO1可能是生长激素细胞分化过程中NEUROD4的上游调节因子。然而,尚不清楚这一机制,因为人胎儿生长营养细胞中的scRNA-seq测序表明,NEUROD4在FOXO1表达之前上调。在很大程度上尚未建立NEUROD4和FOXO1以及其他参与该转录组学调节网络的辅助因子的时间序列和动态。

有趣的是,生长激素细胞中CEBPD的过表达表明,分化的垂体细胞积极抑制改变的细胞命运。在细胞培养中,CEBPD过表达会抑制PRL表达和乳泌乳素细胞增殖,而使用小干扰RNA敲低CEBPD会导致PRL表达增加。因此,生长激素细胞持续表达CEBPD以抑制其他PIT1谱系分化是合理的。这是特别有趣的,因为传统的垂体细胞分化模型通常将谱系特异性转录因子视为细胞命运的启动子,而抑制机制,如在CEBPD中看到的,并没有得到很好的认识。转录因子可能允许细胞分化双向促进细胞命运和抑制改变的命运-这可能解释了为什么细胞命运如此抗拒改变。

2.4. 发育过程中和发育后的正常泌乳素细胞转录途径

在正常的泌乳素细胞中,标志基因PRL的转录需要RAS激活PIT1。POU4F1和NR4A2也增加了PIT1细胞中PRL的表达。NR4A2直接与PRL启动子结合,而POU4F1在不与PRL启动子结合的情况下增强PRL表达,可能是通过未知的调控因子。与单独表达POU4F1相比,共表达POU4F1和NR4A2导致更稳健的PRL表达,这表明它们对PRL具有协同作用。值得注意的是,POU4F1似乎是泌乳素细胞分化所必需的,因为没有POU4F1的NR4A2不足以增加PRL。

成年小鼠和大鼠垂体的单细胞转录组学分析指出泌乳素细胞基因表达的显著性别特异性差异。这并不奇怪,因为性成熟、生殖和发育需要依赖性别的内分泌需求和调节。与男性泌乳素细胞相比,女性泌乳素细胞除了表达较高水平的PRL外,还表达更多涉及神经传递和内分泌释放机制的基因,如drd4(多巴胺受体)、gal(甘丙肽galanin)和grik1(亚基1型离子型谷氨酸受体,[ionotropic glutamate receptor, type subunit 1])。虽然很难确定这些性别特异性的转录组学差异是否反映了一种短暂的细胞状态,如哺乳期间的生理变化,或永久性的抗变化状态(physiological change during lactation, or permanent status resistant to change),但它们指出了进一步的细胞多样性和复杂性,允许垂体-外周在正常生理状态下保持稳态。在另一项研究中,成年雌性小鼠的PIT1细胞簇显示出泌乳素细胞相对于生长激素细胞的相对优势,这表明雌性和雄性的垂体细胞类型组成也不同。因此,未来的研究检查垂体功能和疾病,包括垂体神经内分泌肿瘤,应该仔细考虑垂体激素表达和细胞类型组成的基线性别差异,这可能会导致解释的偏差。

2.5. 发育过程中和发育后正常促甲状腺激素细胞的转录途径

在正常的促甲状腺激素细胞中,转录因子GATA和PIT1相互作用驱动TSHβ基因的表达。人胎儿垂体ScRNA-seq测序显示GATA2的转录可能涉及两个SoxC家族基因SOX4和SOX11,这两个基因在GATA2表达之前表达,并与促甲状腺激素前体细胞中GATA2的调控区结合。对促甲状腺激素细胞培养的Bulk RNA-seq测序和ATAC-seq测序分别显示GATA2在促甲状腺素细胞中高表达,GATA2上游有大面积可达染色质。垂体特异性GATA2敲除小鼠在甲状腺功能减退诱导下表现出短暂的促甲状腺激素细胞损失和TSH生成减少,此外还损害了促性腺激素功能。然而,在成熟的GATA2敲除小鼠中,促甲状腺激素细胞群的最终恢复表明GATA2单独不能决定促甲状腺激素细胞的命运和维持。在同一项研究中,GATA2敲除小鼠表现出GATA3等其他转录物水平的升高,这表明在促甲状腺素细胞中可能存在反馈调节或补偿机制。考虑到一些垂体细胞谱系特异性转录因子似乎是可有可无的,而不是终端细胞命运所必需的,垂体细胞转录级联可能不是传统模型中的线性,而是一个涉及多个转录因子的多向网络,具有微妙的影响和先天的代偿机制。

转录因子ISL1在分化和出生后的促甲状腺激素细胞中表达。它与促甲状腺激素细胞功能有关,在促甲状腺激素细胞增生(Cga-/-)小鼠模型中ISL1转录本增加所提示。然而,虽然在TSH-Cre小鼠中删除ISL1会导致类似甲状腺功能减退的表型,但它并不完全消除甲状腺激素细胞,类似于GATA2敲除小鼠。一种解释可能是,ISL1等转录因子对细胞功能的影响可能比细胞分化更重要,尽管描述这些差异可能很困难。此外,如前所述,多个转录因子可以同时维持正常的稳态,而实验操作(即,敲除)一个转录因子,虽然足以降低细胞功能,如激素分泌,但可能不足以消除垂体细胞谱系。

2.6. 发育过程中和发育后的正常促性腺激素细胞(SF1谱系)转录因子

正常促性腺激素的分化涉及SF1(也称为NR5A1),这是一种锌指核受体( a zinc finger nuclear receptor),在肾上腺、性腺和下丘脑中调节多种性别决定和生殖基因。SF1的转录部分依赖于雌激素与雌激素受体α (ER - α)的结合,其介导了体外SF1增强子和启动子的染色质重塑。对人垂体细胞的ScRNA-seq测序和染色质可及性分析显示ER- α是与SF1表达相关的最重要的转录因子。垂体特异性SF1敲除α -GSU- CRE小鼠导致性腺功能减退,LH和FSH表达降低。有趣的是,SF1对于促性腺激素细胞分化可能是重要的,但不是必需的,因为高剂量的外源性GnRH可以挽救SF1敲除小鼠[38]中LH表达的缺失。

GATA2早于SF1表达,也在促性腺激素细胞分化中发挥作用,因为GATA2失活导致促性腺激素表达减少。此外,小鼠垂体的scRNA-seq测序显示,在促性腺激素细胞中编码FOXP2的转录富集(enrichment),FOXP2是一种新的叉头同源框转录因子(FOXP2, a novel forkhead homeobox tranion factor)。在体内,FOXP2与LH和FSH共区域化(co-localize),但其在促性腺激素细胞功能和分化中的确切作用仍有待阐明。

在人类胎儿垂体中,基于scRNA-seq测序基因表达谱推断谱系中的细胞顺序的假性时间分析揭示了两个多步发育轨迹,其中包含GATA阳性/ NR5A 1阴性,“前促性腺激素细胞”中间细胞状态。中间细胞分化为NR5A1阳性促性腺激素的两个亚型,其特征是绒毛膜促性腺激素和FSH激素的不同表达模式。其中一个亚型富含参与激素生物合成过程和胞吐的差异表达基因。这表明,至少在发育阶段,存在具有如分泌特定激素特定功能的异质促性腺激素细胞种群,可能在建立早期下丘脑-垂体-性腺轴方面发挥作用。有趣的是,在同一项研究中,促性腺激素细胞的一个子集也表达MC2R,一种ACTH受体,这表明在发育过程中促性腺激素细胞和促肾上腺皮质激素细胞谱系之间可能存在串扰。同样,中间促肾上腺皮质激素的一个子集表达一些促性腺激素相关标志物。仍不清楚是否继续存在促性腺激素-促肾上腺皮质激细胞的串扰成人健康垂体。

3. PitNETs的转录组学景观

PitNETs的发病机制是一个复杂的过程,包括异常的转录组学变化,以及其他内在和外在的驱动因素,导致细胞周期失调、肿瘤抑制因子缺失和信号传导缺陷( a complex process that involves abnormal tranomic changes, among other intrinsic and extrinsic drivers, that result in cell cycle dysregulation, loss of tumor suppressor factors, and signaling defects )。PitNETs根据其谱系限制性垂体转录因子进行分类(例如,TPIT用于促肾上腺皮质激素细胞腺瘤;PIT1用于生长激素细胞、泌乳素细胞和促甲状腺素细胞腺瘤;SF1治疗促性腺激素细胞腺瘤;以及零细胞腺瘤的PIT1、TPIT和SF1缺失),这些在2017年世界卫生组织(WHO)分类指南中首次描述,并在2022年指南中保留。最近的研究检查了状态依赖的细胞转录组学变化,为PitNET肿瘤发生的复杂性提供了更深入的见解,并有助于确定这些变化中哪些反映了发育转录组学编程的劫持,哪些是PitNET肿瘤发生的新变化。

3.1.促肾上腺皮质激素细胞垂体神经内分泌肿瘤( PitNETs)

在30-60%分泌ACTH 的PitNETs中,泛素特异性蛋白酶8 (USP8)和表皮生长因子受体(EGFR)通路的异常调控起着重要作用,这两种通路均与胎儿促肾上腺皮质激素细胞发育无关。人类促肾上腺皮质营养激素PitNETs的全外显子组测序揭示了USP8的体细胞突变。USP8突变是促肾上腺皮质激素细胞PitNETs所特有的;其他PitNETs在靶向测序上不显示USP8突变。在正常情况下,USP8去泛素化多种蛋白质,包括EGFR,并阻止其溶酶体降解。USP8功能获得性突变导致EGFR去泛素化活性升高,从而增加了EGFR在质膜中的积累。增强的EGFR信号通路增加了小鼠促肾上腺皮质激素细胞腺瘤细胞系(即AtT20)中的POMC转录和ACTH分泌。相反,EGFR抑制剂(即吉非替尼)抑制人促肾上腺皮质激素细胞PitNETs培养细胞中的POMC转录。与这些发现相一致,USP8突变的促肾上腺皮质激素细胞PitNETs表现出较高的EGFR表达发生率,USP8敲除降低体外ACTH分泌。

相比之下,在无USP8突变(即USP8野生型)的促肾上腺皮质激素细胞PitNETs中进行的全外显子组测序研究确定了BRAF和USP48突变。与USP8相似,BRAF和USP48突变是促肾上腺皮质激素细胞PitNETs所特有的。BRAF和USP48突变增加了体外POMC转录,并增强了上游皮质醇释放激素(CRH)的刺激作用。此外,BRAF突变患者血浆ACTH和皮质醇较高。虽然这些发现对于开发靶向治疗是令人鼓舞的,但靶向USP8、USP48和BRAF是否足以在体内减弱库欣病的表型仍未得到答案。

如前所述,转录因子NEUROD1在人胎儿垂体促肾上腺皮质激素细胞谱系发育的中间状态达到峰值,而MNX1在正常人类成人垂体促肾上腺皮质激素细胞中保持上调。促肾上腺皮质激素细胞PitNETs的Bulk-RNA序列显示MNX1轻度上调,而NEUROD1表达保持低水平,这表明促肾上腺皮质激素细胞PitNETs可能代表一种分化良好的细胞状态。相比之下,一项对促肾上腺皮质激素细胞PitNETs的scRNA-seq测序研究表明相反的情况,可能指向一种去分化的细胞状态,即NEUROD1的上调。这些研究中的差异可能是由于采用了不同的方法(即,除了促肾上腺皮质激素细胞外,bulk-RNA序列捕获了多种细胞类型)或患者的瘤间变异。使用谱系追踪等工具,将PitNETs中谱系特异性转录因子表达的时间序列与健康细胞的时间序列进行比较,这对于阐明这些差异至关重要。

促肾上腺皮质激素细胞PitNETs表现出异质性表型,包括肿瘤进袭性的可变性和分泌ACTH的能力。对促肾上腺皮质激素细胞PitNETs的转录组学分析表明,肿瘤行为与差异表达基因相关(图2)。在微阵列分析和qRT-PCR验证中,与非侵袭性促肾上腺皮质激素细胞PitNETs相比,侵袭性促肾上腺皮质激素细胞PitNETs表现出细胞周期蛋白D2 (CCND2)和锌指蛋白676 (ZNF676)上调,死亡相关蛋白激酶1 (DAPK1)和TIMP金属蛋白酶抑制剂2 (TIMP2)下调。CCND2和DAPK1调节细胞周期,TIMP2调节细胞外基质稳态。ZNF676在端粒稳态中发挥作用,但对端粒调节异常是否参与PitNETs发病仍存在争议。在另一项研究中,bulk-RNA-seq测序揭示了侵袭性促肾上腺皮质激素细胞PitNETs中分泌卷曲相关蛋白2 (SFRP2)的下调。SFRP2调控Wnt信号通路,并作为肿瘤抑制因子。

使用scRNA-seq测序比较静默性和高分泌促肾上腺皮质激素细胞PitNETs在肿瘤细胞中显示出强烈的转录组学差异。与高分泌的促肾上腺皮质激素细胞PitNETs相比,静默性促肾上腺皮质激素细胞PitNETs在激素前处理(即激素转化酶(PC1/3)、信号肽酶(SPCS1)和二肽基肽酶(DPP7))、分泌囊泡调节(即颗粒蛋白(SCG))和胞吐调节(即细胞骨架成分(ACTB、PFN1、GSN、MYL12A))相关的基因水平显著降低。静默性促肾上腺皮质激素细胞PitNETs表现出较高的器官发生基因表达(即PITX1, SIX3),这表明细胞处于去分化状态。此外,静默性促肾上腺皮质激素细胞PitNETs表现出上皮向间充质转化的特征(即N -钙粘蛋白(CDH2)和间充质基质标记物(COL1A1, COL4A1)),表明肿瘤迁移潜力增加。与这些发现一致的是,在静默性促肾上腺皮质激素细胞PitNETs中,而在高分泌的促肾上腺皮质激素细胞PitNETs中,基质细胞表现出较高的血管平滑肌细胞和周细胞标志物,反映了促进血管生成的微环境。因此,进一步的机制研究检查垂体肿瘤细胞和微环境之间独特的双向相互作用,包括间质失调,可能是理解肿瘤发生过程所必需的。最近的一项转录组学研究表明,蛋白酶体凋亡通路在促肾上腺皮质激素细胞PitNET的发病机制中发挥作用。高分泌促肾上腺皮质激素细胞PitNETs的ScRNA-seq测序显示PMAIP1上调,PMAIP1编码促凋亡的noxa蛋白。有趣的是,尽管PMAIP1的转录和表观遗传上调,高分泌的促肾上腺皮质激素细胞PitNETs通过蛋白酶体降解noxa蛋白来逃避凋亡。蛋白酶体抑制剂(即硼替佐米bortezomib)可以拯救noxa蛋白,并抑制患者来源的促肾上腺皮质激素细胞肿瘤细胞系的生长。虽然体内研究是必要的,但库欣病中的蛋白酶体系统(the proteasomesystem)可能是一个潜在的药物靶点。

3.2. 生长激素细胞PitNETs

先前的研究已经确定了GNAS的体细胞突变,该基因是正常发育完全的生长激素细胞信号的一部分,但不是发育中的胎儿生长激素细胞,在高达40%的生长激素细胞PitNETs中。这些突变是功能获得性( gain-of-function)GNAS突变,导致腺苷酸环化酶的组成性激活和生长激素细胞的自主分泌( resulting in constitutive activation of adenylyl cyclase and autonomous secretion of growth hormone)。GNAS突变更常见于较小尺寸的生长激素细胞PitNETs,并与组织学上的致密颗粒性变异相关(are associated with the densely granulated variant on histology)。一些研究表明,GNAS突变与较好的对生长抑素受体类似物反应有关,但这些发现在文献中并不一致,需要进一步研究。在一项bulk-RNA序列研究中,GNAS突变的生长激素细胞PitNETs与D2R的高表达相关,这表明多巴胺激动剂可能对肢端肥大症患者亚型有益。另一项bulk-RNA序列研究表明,特异性生长抑素受体5 (SSTR5)在生长激素细胞PitNETs中过表达,部分解释了帕瑞肽(pasireotide)对SSTR5的亲和力高于SSTR2的优越疗效。生长抑素和多巴胺受体也被认为相互作用并形成不同的复合物(即异源二聚体[heterodimerization]),抑制腺苷酸环化酶[ adenylyl cyclase],限制生长激素的分泌和增殖。然而,目前尚不清楚这种机制在PitNETs中是否具有生物学或治疗意义。进一步描述生长抑素和多巴胺受体表达谱,包括它们的受体亚型和分子相互作用,在药物敏感和耐药的生长激素细胞PitNETs中,可能为设计针对这些肿瘤的最佳受体靶向治疗策略提供了机会。

与正常发育的生长激素细胞相似,NEUROD4在生长激素细胞PitNETs中表达上调。如前所述,NEUROD4是一个关键的转录因子,在正常生长激素细胞的终末分化中与FOXO1密切合作,尽管NEUROD4是FOXO1的上游还是下游还存在争议。有趣的是,尽管NEUROD4上调,但生长激素细胞PitNETs[52]中FOXO1表达似乎没有明显变化。这表明生长激素细胞PitNETs可能利用FOXO1独立的途径进行细胞增殖,可能会招募其他尚未确定的下游转录因子。也有可能在细胞增殖不受抑制的情况下,FOXO1可能被负反馈机制抑制。

最近的一项scRNA-seq测序研究发现生长激素细胞PitNETs中GHRHR、GH1和GH2的高表达,与它们的功能亢进状态一致。此外,与正常的生长激素细胞相比,参与激素胞吐(即CG3、ANXA2、CLU和GAA)和分泌(即A1BG、HEXB、ATP6V0A1、ATP6AP1、PSAP和PSMA5)的额外基因上调。同样的研究发现,AMIGO2在生长激素细胞PitNETs中,以及在促性腺激素细胞和泌乳素细胞PitNETs中上调。AMIGO2是一种跨膜蛋白,此前已被发现与黑色素瘤等其他癌症的发病机制有关,但其在PitNET发病机制中的机制有待进一步研究。鉴于大多数(~76%)差异表达基因在生长激素细胞瘤细胞中上调,检测影响全局基因表达的染色质可及性异常变化将是有趣的。

3.3 泌乳素细胞PitNETs

在20%的散发的泌乳素细胞PitNETs中,剪接因子3亚基B1 (SF3B1)的体细胞突变是一个决定性的遗传特征。SF3B1突变未出现在其他类型的PitNETs中,且与胎儿泌乳素细胞发育无关,尽管它涉及多种非垂体肿瘤。在具有SF3B1突变的泌乳素细胞PitNETs中RNA-seq测序显示雌激素相关受体γ (ESRRG)表达增加。这种功能获得机制可能涉及异常的选择性剪接。值得注意的是,与典型ESRRG相比,SF3B1突变组的ESRRG对PIT-1的亲和力较高,PRL的转录激活较强,从而导致细胞增殖增强。SF3B1突变还下调了泌乳素细胞PitNETs中的抑癌基因Disc large 1 (DLG1),从而促进体外肿瘤细胞的迁移和侵袭。

如前所述,ZBTB20在正常的泌乳素细胞发育和成熟过程中起着至关重要的作用。更具体地说,它参与PRL的表达。考虑到大多数泌乳素细胞PitNETs具有功能并分泌催乳素,似乎ZBTB20在泌乳素细胞PitNETs中高度表达。然而,与其他类型的PitNET相比,ZBTB20在泌乳素细胞PitNET中似乎没有差异表达,尽管无法与正常的泌乳素细胞进行直接比较。与正常的泌乳素细胞不同,泌乳素细胞PitNETs中的泌乳素高分泌可能不依赖于ZBTB20,可能依赖于其他转录因子。

经典的动物模型研究表明,多巴胺信号通路可能在泌乳素PitNETs的发病机制中发挥重要作用。缺乏多巴胺2受体(D2Rs)的小鼠表现出高泌乳素血症和泌乳素细胞腺瘤的发展,而缺乏多巴胺转运体(DT)的小鼠,其多巴胺能张力增加,表现出泌乳素细胞和生长激素细胞数量减少。迄今为止,这些小鼠研究还没有被任何确定人类泌乳素细胞PitNETs中DRD2基因突变的研究所证实。

在耐多巴胺激动剂药物(即卡麦角林和溴隐亭)的泌乳素细胞PitNETs亚群中,研究表明D2R亚型和D2R下游的抑制性G蛋白亚基(Gαi)表达降低。然而,多巴胺激动剂对D2Rs的亲和力似乎没有变化。此外,RT-PCR检测少数靶向基因显示,神经生长因子-B受体(neural growth factor-B receptor, NGFR)在耐药泌乳素细胞PitNETs中的表达也较低。NGFR通过NF-kB细胞内信号通路调控D2Rs的表达。低NGFR可能抑制D2R表达,使个体容易进入多巴胺激动剂抵抗状态。然而,在很大程度上仍然未知耐药和敏感的泌乳素细胞PitNETs的分子基础。这可能涉及到调节D2Rs功能表达的额外基因(即受体呈现、内化、降解、转运[receptor presentation, internalization, degradation, trafficking])和非D2R相关因素(即雌激素或泌乳素受体增加)。

微阵列转录组学研究已经确定了非侵袭性和进袭性-侵袭性泌乳素细胞PitNETs中差异表达的基因。非侵袭性泌乳素细胞PitNETs显示与增殖相关的基因(即CENPE、PTTG和CCNB1)下调,与肿瘤抑制因子DGL1相关的基因(即KIF13B)上调。值得注意的是,PTTG是一种涉及多种癌症并与转移潜力相关的致癌基因。相反,进袭性-侵袭性泌乳素细胞PitNETs表现出垂体发育转录因子PITX1和参与p53依赖性凋亡通路的钠通道亚基SCN3B的下调。此外,它们还表现出金属蛋白酶(即ADAMTS6)的上调。尚不清楚ADAMTS6在肿瘤发展中的作用,因为它似乎是一种肿瘤抑制剂或促肿瘤剂,取决于癌症类型。虽然在分子上定义泌乳素瘤的侵袭性仍然具有挑战性,但鼓励未来在单细胞水平上进行多组学研究,以捕捉进一步微妙但实质性的转录组学变异,这些变异驱动了具有良好特征的患者中泌乳素细胞肿瘤的异质性行为。

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3.4. 促甲状腺素细胞PitNETs

由于促甲状腺素细胞PitNETs罕见,约占所有PitNET的1%,迄今为止尚未很好地定义促甲状腺素细胞PitNET发病的分子机制。与促肾上腺皮质激素细胞PitNETs和生长激素细胞PitNETs不同,促甲状腺素细胞PitNETs中尚未发现复发性体细胞突变。在有限样本的研究中,促甲状腺素细胞PitNETs没有表现出编码G蛋白亚基(包括αq和α11)或促甲状腺激素释放激素受体的激活突变。然而,不能排除涉及驱动肿瘤发生的下游成分的基因表达改变。一些研究指出甲状腺受体β的体细胞突变导致甲状腺介导的负调控受损[。相反,其他人认为甲状腺受体-β的基因表达异常而无体细胞突变;因此,这些发现是有争议的。在一项大量RNA-seq测序研究中,促甲状腺素细胞PitNET与多激素PIT-1阳性细胞腺瘤和稀疏颗粒型生长激素细胞PitNET共享转录组学特征,这表明WHO组织学分类和转录组分析之间存在微妙差异,转录组学分析表明亚型之间的重叠比用于定义WHO亚型的免疫染色的更大。

3.5.促性腺激素细胞PitNETs和零细胞PitNETs

促性腺激素细胞PitNETs(临床上通常是静默性的,不会过度分泌与其谱系相关的FSH或LH激素),与零细胞PitNETs在这里被分组在一起,因为它们的分类仍然存在一些不确定性,并且它们之间存在一些重叠。虽然2017年WHO对垂体肿瘤的分类区分静默的促性腺激素细胞瘤(SF1阳性)和零细胞瘤(细胞类型特异性转录因子阴性)具有临床相关性,因为零细胞腺瘤具有更强的进袭性和较差的临床结局,但研究表明零细胞腺瘤和促性腺细胞PitNETs的转录组学谱可能没有太大差异。通过bulk-RNA-seq测序对PitNETs进行无监督的分类(Unsupervised classification),显示在促性腺激素细胞PitNET (n = 29)聚类中包含零细胞腺瘤(n = 8)。带有一个零细胞腺瘤的PitNETs的ScRNA-seq测序通常支持这一发现。因此,进一步讨论当前的促性腺激素细胞PitNETs类别是否也应包括零细胞腺瘤可能是必要的。此外,在静默性促肾上腺皮质激素细胞和生长激素细胞PitNETs子集中发现了促性腺激素细胞转录组学特征,这表明促性腺激素细胞PitNETs本身可能不支持单独的亚型。

如前所述,有证据表明,在正常的胎儿垂体发育过程中,促性腺激素细胞和促肾上腺皮质激素细胞谱系之间存在串扰(crosstalk)。如果这种串扰在成年期持续存在,具有促性腺激素细胞和促肾上腺皮质激素细胞特征的细胞类型可能是促性腺激素细胞-促肾上腺皮质激素细胞肿瘤的起源细胞。另外,如果促性腺激素细胞-促肾上腺皮质激素细胞的相互作用只是胎儿发育期间的一种短暂现象——代表一种中间细胞状态——促性腺激素细胞-促肾上腺皮质激素细胞PitNETs可能反映一种更加去分化的状态。

静默的促性腺激素细胞PitNETs的无功能状态反映在参与激素产生的关键基因的下调上。例如,与PitNET切除的正常成人垂体细胞相比,静默的促性腺激素细胞肿瘤的scRNA-seq测序表现出LHB、ESR1和GNRHR的下调。这与生长激素细胞PitNETs形成对比,PitNETs通常具有功能性,表现出高激素基因表达。在同一项研究中,促性腺激素细胞PitNETs中的大多数基因下调,包括调控细胞增殖的基因(即CDKN1A、CDKN2A、ZFP36、BTG2、DLG5和ZBTB16)和上皮发育的基因(即KRT8、KRT18和KLF4)。因此,促性腺激素细胞腺瘤可能不仅是激素静默性的,而且可能代表了一种全面减少基因表达更的腺瘤亚型,这可以解释为什么它们与零细胞腺瘤有如此多的重叠。研究表观遗传调控,特别是DNA甲基化静默,可能会提供这种基因表达减少机制的更多细节。

4. 结论

转录组生物学的最新进展,包括单细胞水平RNA测序的发展,为分子解剖垂体提供了机会,垂体是大脑细胞最多样化的区域之一。破译正常的垂体转录组学特征可以让我们更好地了解五种内分泌细胞的本体论起源和发展,这一过程涉及复杂的转录因子级联,目前仍在建立过程中。

与这些关于正常垂体发育的观察平行,最近对PitNETs的发现表明转录因子表达模式的保存和变化。PitNETs的这些研究还指出了驱动各种肿瘤行为的差异表达基因,包括激素过度分泌和肿瘤进袭。了解PitNETs的综合多组学特征对于目前开发基于分子特征的治疗模式无法治愈的PitNETs疗法至关重要,并最终有助于使PitNETs与将精确医学应用于其他肿瘤的突破保持一致。

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